His標(biāo)簽與 IMAC配基
更新時(shí)間：2022-09-22 點(diǎn)擊次數(shù)：1689
IMAC最重要的應(yīng)用是純化His標(biāo)記重組蛋白，融合表達(dá)的His標(biāo)簽為含有6個(gè)或更多組氨酸殘基的片段。His標(biāo)簽具有較高的親和力和特異性，因此在大多數(shù)情況下，IMAC一步純化足以制備一定純度的目標(biāo)蛋白質(zhì)，且可滿足很多應(yīng)用的要求。標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)（即位置、順序和長度）可以從多個(gè)方面影響蛋白質(zhì)的生產(chǎn)：表達(dá)率、與IMAC配基的結(jié)合能力、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)晶體的形成等。His標(biāo)簽最常見的形式是由6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基組成，可以提供6個(gè)金屬結(jié)合位點(diǎn)。大多數(shù)情況下，結(jié)合/解離平衡轉(zhuǎn)換能力越高，使平衡傾向于結(jié)合的方向，結(jié)合能力越穩(wěn)定。Biacore檢測結(jié)果顯示，在pH7.0-7.4時(shí)，六聚組氨酸標(biāo)記蛋白質(zhì)與Ni-NTA的解離速率為1×10?-1.4×10?。然而，平面芯片表面的流動(dòng)性、配體密度和蛋白質(zhì)濃度與多孔隙瓊脂糖顆粒非常不同。此外，His標(biāo)記蛋白質(zhì)與IMAC配基相互作用的穩(wěn)定性受標(biāo)簽的可接近程度和蛋白質(zhì)表面全部螯合殘基（組氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸）數(shù)量的影響。也就是說，通常即使在苛刻的條件下，如果His標(biāo)簽是易接近的（大多數(shù)情況下均是如此），那么對于柱層析，蛋白質(zhì)與Ni-NTA的親和力也是足夠高的。IMACzui常用的配體是亞氨基二乙酸（IDA）和次氨基三乙酸（NTA），與Cu2+、Ni2+、Zn2+等金屬離子配位時(shí)，前者有3個(gè)配位基團(tuán)，后者有4個(gè)配位基團(tuán)。Cu2+、Ni2+、Zn2+這些離子在水溶液中以六配位體化合物的形式存在。螯合配體的配位基團(tuán)多，與金屬螯合牢，但金屬可供蛋白質(zhì)配位的位點(diǎn)少，與蛋白質(zhì)結(jié)合力減弱。因此，一般IDA與蛋白質(zhì)的結(jié)合比NTA強(qiáng)；但是NTA與金屬螯合牢，金屬離子不容易脫落。
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